NYのセントラルパーク動物園から脱走したライオンのアレックス（声：ベン・スティラー）、シマウマのマーティ（クリス・ロック）、カバのグロリア（ジェイダ・ピンケット＝スミス）、キリンのメルマン（デヴィッド・シュワイマー）がマダガスカル島に漂着してから数年後。4頭のニューヨーカーたちが動物園に帰る日が来た。おんぼろ飛行機を操縦するのは、隊長（トム・マクグラス）以下、見事なチームワークを見せるペンギンズ4匹たち。島に王国を築くキツネザルのキング・ジュリアン（サシャ・バロン・コーエン）やアイアイのモーリス（セドリック・ジ・エンターテイナー）も同乗した。しかし、飛行機が飛び立つとすぐに燃料が切れ、アフリカの広大な大地に不時着する。保護区の柵の外から来たという4頭たちの周りに群がる様々な動物たち。その中でアレックスは、両親との再会を果たす。マーティは、夢に見たシマウマの群れと走るが、あまりにも自分と似ている仲間たちに複雑な気持ちが芽生える。健康オタクのメルマンは、アフリカに医者がいないことにびっくり。グロリアは、恋人がほしい時期にさしかかり、偶然にも雄カバのモトモト（ウィル・アイ・アム）と出会う。ペンギンズは、人間たちが乗るサファリカーを襲撃、サルたちと協力し飛行機の修理にとりかかる。だが、アフリカでの生活が続く彼らに、それぞれの試練が訪れる。メルマンは、モトモトとデート中のグロリアに自分の思いを告げ、マーティは群れの中で次第にアイデンティティを失っていく。そんな中、動物たちにとって命の糧である水場が干上がってしまい、アレックスはこの状況を何とかしようと保護区の外へ出て行こうと決断する。一方、キング・ジュリアンたちは、水の神にいけにえを捧げるため火山の噴火口に身を投げる動物を探していたが、なんとメルマンが立候補。柵の外に出たアレックスも、銃を持った人間たちに囲まれて絶体絶命のピンチに見舞われていた……。