幼くして両親を失ったピーター・パーカー（トビー・マグワイア）は伯父夫妻に引き取られ、NY郊外のクイーンズに暮らしていた。幼なじみの同級生メリー・ジェーン（キルスティン・ダンスト）に密かに思いを寄せつつ、化学の勉強に精を出す日々。そんなある日、遺伝子を組み換えたスーパースパイダーに刺されたピーターは、身体に異変が起きはじめ、強靭な肉体と蜘蛛のような特殊能力を持つようになる。高校卒業後、カレッジに入学したピーターは、親友ハリー（ジェームズ・フランコ）とマンハッタンで共同生活を開始。女優志望のメリー・ジェーンも上京していたが、彼女はハリーと付き合うようになっていた。一方ピーターは、スパイダーマンとなって正義の活動をし、その姿を自ら撮影して売り込む報道カメラマンのバイトで生活を支える毎日。その頃、天才科学者であるハリーの父親ノーマン（ウィレム・デフォー）が、軍事目的で開発した新薬を自ら服用。その副作用で彼は二重人格となり、邪悪なサイドの性格が世界征服を企むグリーン・ゴブリンという怪物を生み出した。ノーマンはグリーン・ゴブリンとなってマンハッタンを攻撃。駆け付けたスパイダーマンと対峙したグリーン・ゴブリンは、彼に世界征服の共謀を持ちかけるが、スパイダーマンは正義を貫くことを選ぶ。やがてスパイダーマンとグリーン・ゴブリンは、互いの正体を知りつつ対決する。激しい戦いの中でグリーン・ゴブリンが死亡した。ハリーは自分の父親を殺したスパイダーマンへの恨みを口にするが、ピーターは真相を言えずに苦い気持ちで彼を慰める。そしてメリー・ジェーンは、初めてピーターに愛の告白をするのだが、スパイダーマンとしての重い事情を背負ったピーターは、彼女の申し出を拒否するのだった。