恋人のMJ・ワトソン（キルスティン・ダンスト）がブロードウェイ女優になり、ピーター・パーカー（トビー・マグワイア）はプロポーズを決意する。ある夜、ピーターは何者かに襲われる。敵は父ノーマンの力を受け継ぎ「ニュー・ゴブリン」となったハリー・オズボーン（ジェームス・ブランコ）。闘いの末、ハリーは記憶障害を患い、ピーターが父の仇であることを忘れてしまう。その頃、マルコ（トーマス・ヘイデン・チャーチ）という脱獄囚が警察に追われていた。逃げのびた研究所で分子分解されてしまった彼は、砂の体を持つ「サンドマン」となる。新聞各紙で酷評されたMJが舞台を降板させられる一方、スパイダーマンは名誉市民賞をもらうなど大活躍。誤解やすれ違いもあり、MJと連絡が取れなくなりピーターは焦る。そんな折、ベン伯父さんを殺した真犯人がマルコであると判明する。憎悪に燃えるピーターが目覚めると、謎の黒い液体生物に包まれ、段違いの能力をもつ「ブラック・スパイダーマン」となっていた。その姿でマルコと闘い、ピーターは復讐を果たす。記憶を取り戻したハリーの差し金で、突然MJから別れを告げられるピーター。怒りに任せブラック・スパイダーマンでハリーを倒すが、ピーターとMJの仲も不穏なままとなる。数日後、謎の液体生物は宿主の攻撃性を増幅させる性質があることが判明する。ブラックスーツで性格も攻撃的になるピーターだが、MJを殴ってしまったことをきっかけに我に返りスーツを破り捨てる。宿主を失った液体生物は、ピーターに捏造写真を見破られ職を失ったエディ（トファー・グレイス）に取り付き、新たな敵「ヴェノム」へと姿を変える。ヴェノムは生きていたサンドマンと手を組み、MJを人質に取りスパイダーマンを誘い出す。窮地のスパイダーマンを助けたのは、父の死の真相を知ったハリーであった。MJを救い、敵も退けるが、ハリーは自らを犠牲にピーターを庇い、死んでしまう。ハリーの葬儀の後、シンガーとしてMJが働くジャズクラブをピーターは訪れる。ふたりは抱擁を交わし、愛の絆を取り戻す。